一種與大黃魚抗副溶血弧菌關聯的SNP位點、其篩選方法和應用與流程

文檔序號:19792830發布日期:2020-01-24 15:43
一種與大黃魚抗副溶血弧菌關聯的SNP位點、其篩選方法和應用與流程

本發明屬于魚類分子標記篩選技術領域,涉及一種與大黃魚抗副溶血弧菌關聯的單核苷酸多態性(snp)分子標記,特別涉及一種位于大黃魚ctrp9基因外顯子上與抗副溶血弧菌關聯的snp位點、其篩選方法和應用。



背景技術:

大黃魚(larimichthyscrocea)屬硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科、黃魚屬,是我國近海主要養殖經濟魚類,近些年,由于其養殖環境惡化、養殖規模擴大、養殖密度過大等原因,導致其病害頻發,尤其是副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)感染引起的弧菌病,對大黃魚生長危害極大?;【“l病時間短、死亡快、傳染性極強,嚴重威脅著漁業經濟發展和人們的健康。因此,培育大黃魚抗病品系是預防弧菌的重要途徑之一。

單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism,snp)是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的dna序列多態性,是一種理想的遺傳標記。繼限制性片段長度多態性(rflp)、微衛星標記(ssr)后,snp作為新一代分子標記,在遺傳的多樣性分析、關聯分析、品種鑒定、高密度遺傳連鎖圖譜的構建以及輔助育種等方面有廣泛應用。目前尚未見到有關從免疫相關基因中篩選到與大黃魚抗副溶血弧菌相關的snp位點,以及應用的報道。



技術實現要素:

本發明針對副溶血弧菌感染大黃魚患弧菌病,提供一種位于大黃魚ctrp9基因上與抗副溶血弧菌關聯的snp位點,確定大黃魚免疫相關基因的snp位點與抗副溶血弧菌關聯,為大黃魚抗副溶血弧菌的選育提供分子標記。

本發明中,與大黃魚抗副溶血弧菌相關的snp位點,位于大黃魚如seqidno:1所示的ctrp9基因cdna序列上,全長1368bp,編碼455個氨基酸,其1147位堿基處存在一個a或g的等位基因突變,且該突變引起第383位氨基酸由異亮氨酸(ile)突變為纈氨酸(val)。

本發明還提供了上述與大黃魚抗副溶血弧菌相關的snp位點的篩選方法,包括以下步驟:

(ⅰ)用副溶血弧菌感染大黃魚幼魚后,提取其rna并反轉錄成cdna,其核苷酸序列如seqidno:1所示;

(ⅱ)設計引物對如seqidno:2所述的正向引物和如seqidno:3所示的反向引物,以cdna為模板進行pcr擴增反應;

(ⅲ)經瓊脂糖凝膠檢測,對目的條帶清晰無雜帶的pcr產物進行測序,篩選得到上述snp位點。

步驟(ⅱ)中,所述pcr擴增反應體系25ul為:2×mix12.5ul,正向引物(10um)和反向引物(10um)各1ul,cdna模板1ul,無菌水9.5ul;和/或

所述pcr擴增反應的程序依次為:95℃預變性5min,94℃變性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s(45個循環),72℃終延伸10min。

本發明還提供了上述與大黃魚抗副溶血弧菌相關的snp位點在抗副溶血弧菌大黃魚遺傳育種上的用途。

與現有技術相比,本發明的有益效果是:

本發明對大黃魚免疫相關基因非同義突變snps進行篩選與驗證,snps標記不僅可以評估大黃魚遺傳多樣性,而且為大黃魚的抗病選育等工作提供研發基礎。同時,本發明檢測到大黃魚ctrp9基因與副溶血弧菌抗性相關的snp位點,為大黃魚的抗菌選育工作提供新思路,有利于推進大黃魚的遺傳育種進程,提高大黃魚養殖經濟效益。

附圖說明

圖1是大黃魚ctrp9基因的snp位點峰型圖,自上而下依次為副溶血弧菌易感組和抗副溶血弧菌組。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。

以下實例中大黃魚ctrp9基因上與抗副溶血弧菌關聯的snp位點的篩選方法,通過用副溶血弧菌感染大黃魚幼魚,提取rna并反轉錄成cdna,采用引物設計、pcr擴增測序、snp位點篩選獲得snp位點,利用spss18.0軟件對感染前后抗感易感群體的基因型頻率進行差異顯著性分析,采用bioedit軟件進行分型獲得與抗副溶血弧菌相關的snp位點,具體步驟如下:

(1)大黃魚暫養、馴化

出膜40天、1~2cm的大黃魚苗由象山港水產引種育種有限公司贈送,放到1.0m(內徑)×1.2m(高)的養殖桶里暫養3~4天,水體高1m,溫度26℃,每天投餌2次(早上7:00、下午6:30),換水2次,每次換水90%,清理底部食物殘渣及糞便。為了防止大黃魚患白點病,換水時加入5ml甲醛,濃度為0.005‰。待魚苗適應環境、進食穩定后,將暫養的大黃魚移入實驗缸中再進行實驗。

(2)人工感染

實驗水體為長80cm、寬45cm的玻璃缸,加入海水70l,每缸放苗500尾,水溫控制在26℃,魚苗穩定后,進行實驗;設置對照組和副溶血弧菌(atcc17802)感染實驗組,濃度為1.5×107cfu/ml,實驗組和對照組均設置3個平行組。各缸每隔24h投喂一次餌料,清理掉食物殘渣和糞便,換水1/3,并補充感染菌以維持其恒定的濃度。每天清理、記錄各缸中死苗數,rna保護液保存死亡樣本用于后續pcr驗證。

(3)轉錄組分析

取實驗第七天的對照組、副溶血弧菌感染患病的、副溶血弧菌感染未患病的樣本各三條,trizol法提取樣本總rna,混合后質檢、建庫,用truseqpeclusterkit在cbot中進行clustergeneration,然后在illuminahiseqtm2500中進行雙向測序。測序得的rawreads去除低質量和錯誤堿基后得到cleanreads,以模式生物斑馬魚轉錄組數據為參考序列進行比對,對測序數據的kegg通路、差異表達基因和snp進行分析。從轉錄組中篩選免疫相關的kegg通路,根據通路中的免疫相關因子從差異表達基因中篩選差異的免疫基因,并篩選免疫基因的有義突變位點。

從抗副溶血弧菌組與對照組中篩選出127個免疫差異基因,其中有53個免疫基因上調,73個下調基因;53個免疫上調基因中共發現29個基因編碼區存在146個snp位點,其中非同義突變位點有28個。

(4)pcr擴增及測序

選擇對照組、副溶血弧菌感染第四天死亡(易感)、第七天存活(抗感)的大黃魚,各10尾、共30尾,分別提取整魚的總rna。以提取的rna為模版用takara公司的primescripttmii1standcdnasynthesiskit反轉錄成cdna,-20℃保存備用。

設計引物對序列如下所示:

primerf:agcctaaccttcctgttcctttctatactatcattt

primerr:ggtggtgttgccatcgggacctt。

采用上述引物以cdna為模板進行pcr擴增,選擇諾唯贊公司的2×taqplusmastermix(dyeplus)試劑進行pcr反應,反應體系25ul:2×mix12.5ul,primerf(10um)和primerr(10um)各1ul,cdna模板1ul,無菌水9.5ul。擴增反應器為eppendorfpcr儀(艾本德,德國)。pcr程序:95℃預變性5min,94℃變性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s(45個循環),72℃終延伸10min。pcr產物經瓊脂糖凝膠檢測、目的條帶清晰無雜帶,剩余產物送上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

(5)基因型的判定及數據分析

根據測序結果用bioedit軟件觀察測序峰型圖,進而確定snps位點的基因型;單峰為純合子基因型,雙峰為雜合子基因型。以上數據用spss18.0軟件對對照組、第四天死亡樣本(易感)、第七天存活樣本(抗感)進行單因素方差分析(p<0.05:顯著性差異;p<0.01:極顯著差異)。結果發現:ctrp9基因型頻率在副溶血弧菌抗感易感群體中存在極顯著性差異,其他免疫基因如nf-kappa-binhibitorzeta-like、glutathiones-transferaseomega1、galectin-4、tyrosine-proteinkinasestyk1-like、apobec1complementationfactor、interferonregulatoryfactor2-bindingprotein1-like、arginase基因在副溶血弧菌實驗組樣本中不存在顯著性差異。

(6)擴大樣本檢測ctrp9基因snp位點

為了更準確驗證ctrp9基因snp位點在副溶血弧菌感染組樣本中的情況,增加對照組樣本至20尾、副溶血弧菌易感組至18尾、抗副溶血弧菌組至16尾,對ctrp9基因的兩個snp位點進一步驗證。

如圖1所示的副溶血弧菌易感組18個樣本和抗副溶血弧菌組16個樣本一代測序峰型圖,snp位點ctrp9-1147-a/g在副溶血弧菌易感組中的基因型頻率分別為aa22.2%、ag77.8%、gg0,在抗副溶血弧菌組中aa37.5%、ag25%、gg37.5%。ctrp9基因的ile突變為val位點,副溶血弧菌易感組與抗副溶血弧菌組間存在極顯著性差異,但是抗副溶血弧菌組與對照組不存在顯著性差異,如表1所示。

表1:ctrp9基因在副溶血弧菌實驗組snp位點統計

由表1可知,snp位點ctrp9-1147-a/g在副溶血弧菌抗感易感組基因型頻率存在極顯著性差異x2=11.879,p<0.01。表明snp位點ctrp9-1147-a/g在副溶血弧菌抗感易感群體中存在極顯著性差異,此位點與大黃魚抗副溶血弧菌相關聯。以上數據分析顯示snp位點ctrp9-1147-a/g在副溶血弧菌抗感和易感群體中基因型頻率分別為gg37.5%和0,存在極顯著性差異(p<0.01)。

snp位點ctrp9-31147-gg基因型可以作為大黃魚抗副溶血弧菌的候選基因,用于指導大黃魚的分子標記輔助選擇育種。與現有大黃魚抗菌育種技術相比,從基因角度出發,本發明篩選到與大黃魚抗副溶血弧菌相關的snp位點,并把此位點運用在大黃魚育種工作中,有望從遺傳角度根本性的解決大黃魚患弧菌病問題。

序列表

<110>上海海洋大學

<120>一種與大黃魚抗副溶血弧菌關聯的snp位點、其篩選方法和應用

<141>2019-11-18

<160>3

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<212>dna

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